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基因芯片的操作流程及步驟ppt課件下載

素材編號:
419020
素材軟件:
PowerPoint
素材格式:
.ppt
素材上傳:
yangyiner
上傳時間:
2020-07-04
素材大小:
7 MB
素材類別:
生物課件PPT
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基因芯片的操作流程及步驟ppt課件

基因芯片的操作流程及步驟ppt課件免費下載是由PPT寶藏(www.ichenwin.com)會員yangyiner上傳推薦的生物課件PPT, 更新時間為2020-07-04,素材編號419020。

這是基因芯片的操作流程及步驟ppt課件,包括了簡介,我國主要研究單位,基因芯片是信息時代的產物,生物芯片分類,主要類型,基因芯片技術,基因芯片(DNA微陣列),基因芯片基本操作流程,基因芯片設計步驟,原位合成法,結束語,基因芯片技術的主要特點,當前面臨的困難等內容,歡迎點擊下載。


基因芯片結構示意圖
生物芯片的制作步驟
簡介
基因芯片
探針固相原位合成技術與照相平板印刷技術
激光共聚焦顯微技術
中科院遺傳所人類基因組中心
北京大學
聯合基因集團有限公司
我國第一家批量生產基因 芯片
擁有近2千條基因藥物發明專利
東南大學吳健雄實驗室
中科院計算所生物信息學實驗室
上海生科院
我國基因芯片的研究現狀
目前,我國尚未有較成型的基因芯片問世,但據悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術的研制工作,并取得了一些可喜的進展。標志著我國相關學科與技術正在走向成熟。
涉及領域:生命科學、計算機科學、精密機械科學
生物芯片分類
根據用途還可以把生物芯片分為兩類:信息生物芯片(information-biochip)和功能生物芯片(function-biochip)。
基因芯片(gene chip)的原理
基因芯片的測序原理是雜交測序法,即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG,與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時,通過確定熒光強度最強的探針位置 ,獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶序列的核酸。
基因芯片又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)
三種主要類型:
1)固定在聚合物基片(尼龍膜、硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段——通過同位素標記的靶基因與其雜交,通過放射顯影技術進行檢測
2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列——通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測
3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列——與熒光標記的靶基因雜交進行檢測
主要類型
多種方法將寡核苷酸或短肽
固定到固相支持物上
原位合成(in situ synthesis)
合成點樣
支持物:玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等
 基因芯片 /DNA 微陣列 Gene Chip /DNA Microarray
核酸體外雜交技術
2.基因芯片的基本原理分析
任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸,又稱亞序列(subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個8 nt亞序列:
這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。
亞序列中A、T、C、G 4個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。
假如只考慮完全互補的雜交,那么48個8 nt亞序列探針中,僅有上述5個能同靶DNA雜交。
可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針與一個未知的熒光標記DNA/RNA序列雜交,通過對雜交熒光信號檢測,檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸,從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列,最后由計算機對大量熒光信號的譜型(pattern)數據進行分析,重構靶DNA 的互補寡核苷酸序列。
原理 -- 通過雜交檢測信息
二、 基因芯片基本操作流程
制備總RNA→ mRNA經RT--PCR用Cy3(正常對照組)和Cy5(實驗組)熒光標記目的基因,得到cDNA 探針→ 混合標記探針→與表達譜芯片上核苷酸片段(或基因)雜交→掃描→分析雜交結果→結論
載體+寡核苷酸-探針分子+熒光染料-點樣儀-掃描儀-計算機+專業軟件
基因芯片流程(一)
1. 實驗設計
2. 樣品制備(指mRNA或總RNA樣品,包括對照組和實驗組。將mRNA或總RNA分別進行逆轉錄生成cDNA,然后將對照組和實驗組cDNA分別標記Cy3和Cy5熒光信號)
3. 芯片制備(寡核苷酸探針或 cDNA探針,包括PCR,純化,點樣等步驟)
基因芯片流程(二)
4. 芯片雜交(將用Cy3和Cy5熒光標記的對照組和實驗組的cDNA 等量混合,與芯片進行雜交)
5. 芯片掃描(采用激光掃描儀,分別用532nm和635nm波長激光掃描芯片,對于每張芯片,得到Cy3和Cy5通道兩幅圖象)
基因芯片流程(三)
6.. 圖象處理(采用專門軟件,對圖象進行分析,提取每個點上的數字信號,得到原始數據表)
7. 數據校正和篩選(對Cy5或Cy3信號進行校正,消除實驗或掃描等各環節因素對數據的影響,同時利用篩選規則對數據中的“壞點”,“小點”,“低信號點”進行篩選,并作標記)
基因芯片流程(四)
8. 目的基因或序列的確定(采用ratio值對差異基因進行判斷,或采用統計方法如線性回歸、主成分分析、調整P值算法等對差異基因進行統計推斷)
9. 生物信息學分析(如cluster 算法、差異基因的同源性比對,差異基因的相關文獻檢索等)
微流控芯片檢測儀
基因芯片的閱讀分析系統
芯片掃描儀
芯片雜交盒
三、 基因芯片設計步驟
1. 基因芯片設計的一般性原則
基因芯片設計主要包括兩個方面:
探針的設計
指如何選擇芯片上的探針
探針在芯片上的布局
指如何將探針排布在芯片上。
確定芯片所要檢測的目標對象
查詢生物分子數據庫
取得相應的DNA序列數據
 序列對比分析
找出特征序列,作為芯片設計的參照序列。
 數據庫搜索
得到關于序列突變的信息及其它信息。
在進行探針設計和布局時必須考慮以下幾個方面:
   (1)互補性
   (2)敏感性和特異性
   (3)容錯性
   (4)可靠性
   (5)可控性
   (6)可讀性
基因芯片的制作方式
原位合成法
主要為光引導聚合技術(Light-directed synthesis),不僅可用于寡核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。
主要步驟為:
首先使支持物羥基化,并用光敏保護基團將其保護起來。
每次選取適當的蔽光膜(mask)使需要聚合的部位透光,其他部位不透光。
每次通過控制蔽光膜的圖案(透光與不透光)決定哪些區域應被活化,以及所用單體的種類和反應次序就可以實現在待定位點合成大量預定序列寡聚體的目的。
2、光導原位合成法
是在經過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子(linker),其羥基上加有光敏保護基團,可用光照除去,用特制的光刻掩膜(photolithographic mask)保護不需要合成的部位,而暴露合成部位,在光作用下去除羥基上的保護基團,游離羥基,利用化學反應加上第一個核苷酸,所加核苷酸種類及在芯片上的部位預先設定,所引入的核苷酸帶有光敏保護基團,以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成,因而N個核苷酸長的芯片需要4N個步驟。每一個獨特序列的探針稱為一個“feature”,這樣的芯片便具有4N個“feature”,包含了全部長度為N的核苷酸序列。
這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和PCR產物,但是每輪反應所需設計的光柵則是主要的經費消耗。運用這種方法制作的芯片密度可高達106探針/平方厘米,即探針間隔為 5-10μm,但只能制作II型 DNA芯片。
5.針式點樣
玻璃片基的處理:使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團。
點樣針沾取探針溶液。
點樣針把探針點到玻片表面,讓探針末端的化學集團與玻片表面的集團形成共價鍵。
針式點樣的優缺點
優點:成本低,操作簡單,密度高(幾千-幾十萬點/cm2),         轉移過程中探針溶液損失小。
缺點:定量準確性、重現性不好
2202芯片點樣儀
生產商        Bio-Rad 
性能介紹
   分辨率:1.25um(x,y軸)和0.25um(Z軸) ,
   重復性:3um
   球面精確性:l0um。 一次制成芯片數:126塊芯片
  每塊玻片點樣量>82,000個點
6.噴墨點樣
噴墨點樣的方式類似于噴墨打印機。將合成用探針溶液放入打印墨盒內,由電腦依據預定的程序在xyz方向自動控制打印噴頭在芯片支持物上移動,并根據芯片不同位點探針序列需要將特定的探針試劑(不足納升)噴印到特定位點。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發生偶聯反應。
7.分子印章法
根據陣列合成的要求設計并制作表面凹凸不平的分子印章,再按照合成的順序,將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上,逐個依次壓印到芯片特定位點進行合成反應。合成的后續反應與壓電打印類似。
分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片,還可用于DNA微集陣列的制作。
1.樣品制備。
   一般所需mRNA的量是以一張表達譜芯片需要3μg mRNA計算的
待分析基因在與芯片結合探針雜交之前必需進行分離、擴增及標記。根據樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同,采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然,常規的基因分離、擴增及標記技術完全可以采用,但操作繁瑣且費時。
高度集成的微型樣品處理系統如細胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現上述目的的有效手段和發展方向。
為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標記,目前采用的最普遍的熒光標記方法與傳統方法如體外轉錄、PCR、逆轉錄等原理上并無多大差異,只是采用的熒光素種類更多,這可以滿足不同來源樣品的平行分析。
用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結合于芯片上目的基因的熒光信號,通過計算機處理即可給出目的基因的結構或表達信息。
雜交條件的選擇與研究目的有關,多態性分析或者基因測序時,每個核苷酸或突變位點都必須檢測出來。
通常設計出一套四種寡聚核苷酸,在靶序列上跨越每個位點,只在中央位點堿基有所不同,根據每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度,即可測定出該堿基的種類。
如果芯片僅用于檢測基因表達,只需設計出針對基因中的特定區域的幾套寡聚核苷酸即可。
表達檢測需要長的雜交時間,更高的嚴謹性,更高的樣品濃度和低溫度,這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測,要鑒別出單堿基錯配,需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。
(2)激光掃描共焦顯微鏡
激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結構非常相似,但是由于采用了共焦技術因而更具優越性。這種方法可以在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探測,而無須清洗掉未雜交分子,從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計算機控制激光束或樣品池的移動,便可實現對芯片的二維掃描,移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配,在幾分鐘至幾十分鐘內即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高,掃描時間長,比較適合研究用。現在 Affymetrix公司已推出商業化樣機,整套系統約 12萬美元。
樣品在被測定前,首先要經過消化,使待測組織細胞中的DNA或RNA釋放出來,在經過適當的擴增后,以熒光標記物標記,放入基因芯片自動孵育裝置中,由其自動控制反應的時間、溫度以及緩沖液的配比等反應條件,進行雜交。
雜交完成后,要對基因芯片進行“讀片”,即應用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡,對基因芯片表面的每個位點進行檢測。
檢測結合到芯片表面位點的樣品片斷的熒光標記,而待測樣品中未與芯片上探針結合的熒光標記物,則懸浮于溶液中,由于不在聚焦平面上,因而不被檢測。
樣品與探針的錯配是影響雜交反應結果的重要因素,但由于樣品與芯片上的探針正確配對時產生的熒光信號要比錯配時強的多,因此,通過對信號強度的分析,就可以區分正確與錯誤的配對。
 

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