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BrdU染色原理和步驟ppt課件下載

素材編號:
419021
素材軟件:
PowerPoint
素材格式:
.ppt
素材上傳:
yangyiner
上傳時間:
2020-07-04
素材大小:
1 MB
素材類別:
生物課件PPT
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BrdU染色原理和步驟ppt課件

BrdU染色原理和步驟ppt課件免費下載是由PPT寶藏(www.ichenwin.com)會員yangyiner上傳推薦的生物課件PPT, 更新時間為2020-07-04,素材編號419021。

這是BrdU染色原理和步驟ppt課件,包括了BrdU染色原理,操作步驟,改進和發展,注意事項,BrdU染色的進化---EdU等內容,歡迎點擊下載。

BrdU染色原理和步驟
EdU染色方法簡介
BrdU染色原理
BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶的衍生物,常用于標記活細胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復制細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。這種摻入可以穩定存在,隨著DNA復制進入子細胞中。 BrdU 特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入,從而判斷細胞的增殖能力。  BrdU 特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入,從而判斷細胞的增殖能力。
活體注射或細胞培養后利用抗Brdu單克隆抗體,ICC染色,顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物,雙重染色,可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。因組織細胞內無內源性Brdu存在,所以Brdu應用較廣
摻入雙鏈DNA內的Brdu,以氫鏈與腺嘌呤結合,不能直接與抗Brdu抗體反應,需經解鏈使Brdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等,使DNA雙鏈部分單鏈化,抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細胞核內的Brdu結合,再經酶標抗小鼠IgG抗體孵育、呈色,顯示進入S期細胞的情況。
改進和發展
由于鹽酸和蛋白酶處理等可引起抗原或組織形態發生變化。為此,Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體(Bu—1),其培養液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應,因為培養液上清中含有DNA酶,可分解雙鏈DNA,顯露Brdu,達到染色目的。采用戊二醛固定后,胃蛋白酶—鹽酸處理,亦得到了良好的染色結果。用雙重或多重染色、觀察何種細胞分裂增殖時,首先應染色其它抗原物質,最后顯示Brdu。
通常在第一種抗體呈色后,再經1%戊二醛固定5~10min,重復染色程序,均可獲得較滿意的染色結果,分裂細胞核呈棕褐色;顯示其它抗原用ALP標記抗體,則細胞漿為紅色(FR)或藍色(FB)
操作步驟 (1)
(1)細胞以1.5×105 /ml細胞數接種于直徑35 mm培養皿中(內放置一蓋玻片),培養1 d,用含0.4%FBS培養液同步化3 d,使絕大多數細胞處于G0期。
(2)加入BrdU(儲液:1.0 mg/ml,終濃度為0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。
(3)棄培養液,玻片用PBS洗滌3次。
(4)甲醇/醋酸固定10 min。
(5)經固定的玻片空氣干燥,0.3%H2O2 -甲醇
           30 min滅活內源性氧化酶。
(6)5%正常兔血清封閉。
(7)甲酰胺100℃,5 min變性核酸。
(8)冰浴冷卻后PBS洗滌,加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1:50),陰性對照加PBS或血清。
(9)按ABC法進行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數,計算標記指數(LI)。
BrdU staining protocol
Materials and reagents
Hydrogen chloride (HCl), 1 M and 2 M
Borate buffer 0.1 M
Borax (sodium tetraborate) 38.1 g/liter, pH to 9.0
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, with 0.1% Triton X-100
Method
1. Sections of paraffin-embedded tissues should be de-waxed before proceeding.
2. Incubate in HCl (1 M) for 10 min on ice to break open the DNA structure of the labeled cells.
3. This is followed by HCl (2 M) for 10 min at room temperature, then 20 min at 37°C.
4. Immediately after the acid incubations, neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature.
5. Wash in PBS (pH 7.4), 0.1% Triton X-100 3 times, 5 min per wash.
6. Continue with standard staining procedure as described in the immunohistochemistry and cytochemistry protocols.
注意事項
1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml雙蒸水,4℃下避光保存
2.BrdU會肌體造成不可逆損傷,使用時注意安全,避免吸入BrdU粉塵。
BrdU染色的進化---EdU
EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物,其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見,能夠在DNA復制時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在合成的DNA分子中,基于Apollo®熒光染料與EdU的特異性反應即可直接并準確地檢測出DNA復制活性,廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA損傷修復、病毒繁殖等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及各種藥物的細胞增殖及活力篩選實驗。
 

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